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ELISA操作前必讀——【液體樣本處理】

更新時(shí)間:2024-02-26 瀏覽次數(shù):1474

可用于ELISA實(shí)驗(yàn)的樣本一般有血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液以及組織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法也不同。(由于ELISA只能檢測可溶性蛋白質(zhì)的含量,因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì))

液體樣本處理原則:所有的液體樣本,用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)

【血清樣本】:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過夜,然后 1000×g 離心 20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng):收集血液樣本應(yīng)避免溶血,因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì),這種情況下,ELISA實(shí)驗(yàn)中將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng),導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確,出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外,樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染,因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP,也會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

【血漿樣本】:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意事項(xiàng):檢測前請(qǐng)仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說明書,查看該試劑盒針對(duì)抗凝劑是否有特殊要求。

【組織勻漿】:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果),稱重后將組織jian碎。將jian碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

【細(xì)胞培養(yǎng)物上清】:請(qǐng)1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【尿液、胸腹水、腦脊液】:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

【樣品保存】:為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測,請(qǐng)按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測),或-80℃(6個(gè)月內(nèi)檢測),避免反復(fù)凍融,標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

【注意事項(xiàng)】:樣本中不能含有會(huì)抑制HRP活性的NaN3,否則會(huì)造成假陰性結(jié)果。

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